Ботулотоксин А, «Ботокс» — 360°
Ботулотоксин — это яд белковой природы, выделяемый анаэробной почвенной бактерией Clostridium botulinum, один из самых сильных известных токсинов. За 2011 год весь мир израсходовал в медицинских и косметологических целях около 1 грамма чистого токсина [1], а двух килограммов достаточно для того, чтобы убить все население Земли (приблизительная оценка, летальные дозы разных типов токсина различаются). Из почвы споры Clostridium botulinum могут попадать в продукты питания, где при недостатке кислорода прорастают, в результате чего в пище накапливается токсин, который может вызвать отравление. Возможно размножение бактерий в организме человека при инфицировании ран, в также в кишечнике грудных детей, у которых еще не сформировано симбиотическое микробное сообщество. Во всех этих случаях происходит отравление ботулотоксином, и развивается патологическое состояние, которое называется ботулизмом. Существует 7 разных типов ботулотоксина — A, B, C1, D, E, F, G — различающихся особенностями структуры и механизма действия [2]. На человека действуют токсины всех типов, кроме F и G.
Ботулотоксин синтезируется в виде протоксина, который затем разрезается внеклеточной протеазой на две части — тяжелую (100 кДа) и легкую (50 кДа) цепи, соединенные дисульфидным мостиком. С-концевая часть тяжелой цепи необходима для связывания с нейронами, N-концевая — для транслокации легкой цепи через мембрану, в результате чего протеаза оказывается в цитоплазме клетки-мишени. Легкая цепь представляет собой цинковую протеазу термолизин-подобного типа, которая атакует и расщепляет одну из молекул, отвечающих за слияние секреторного пузырька с пресинаптической мембраной — SNAP-25, синтаксин или синаптобревин. В легкой цепи имеется последовательность аминокислот HELIH, типичная для металлопротеаз. [3] Токсин связан с вспомогательными белками — гемагглютинином (НА) и NTNH — которые защищают его от разрушения в пищеварительном тракте жертвы. Комплекс стабилен в кислой среде [4]. Ботулотоксин на 30-40% гомологичен столбнячному токсину (тетанотоксину), и механизм их действия сходен, однако тетанотоксин не образует комплексов со вспомогательными белками, поэтому не всасывается из ЖКТ и не вызывает пищевых отравлений [5]. Противоположное действие этих токсинов на мышечные сокращения связано с тем, что ботулотоксин поражает мотонейроны, и возникает вялый паралич, а тетанотоксин — ингибиторные интернейроны спинного мозга (клетки Реншоу), что приводит к судорогам. Ботулотоксин не проникает через гематоэнцефалический барьер и, в отличие от столбнячного токсина, не подвержен ретроградному транспорту в нейронах. Гены ботулотоксина и вспомогательных белков собраны в кластер, который может находиться в бактериальной хромосоме, плазмиде или фаговом геноме и подвергается горизонтальному переносу между различными штаммами бактерий посредством конъюгации, трансформации или трансдукции. Показана роль IS-элементов в горизонтальном переносе генов токсинов [6]. В целом, Clostridium botulinum — филогенетически гетерогенная группа бактерий, в геноме которых имеется один из типов кластеров, кодирующих токсин и вспомогательные белки [7].
Ботулотоксин попадает в организм с пищей или водой и проникает в кровь через клетки эпителия тонкого кишечника — энтероциты. Также токсин может всасываться в кровь при вдыхании его в виде аэрозоля. Из крови он попадает в окончания двигательных нейронов. Попавший в клетки яд оказывается недоступным для действия иммуной системы организма, поэтому использование для лечения специфических антител к токсину эффективно только на самых ранних стадиях развития заболевания. В силу высокой активности токсина военные ведомства разных стран рассматривали возможность его использования в качестве биологического оружия, а также как террористическую угрозу. Для защиты солдат от возможного отравления в ходе Второй Мировой войны Министерством обороны США была разработана первая вакцина против ботулизма. С 1957 по 2011 год использовалась в основном пентавалентная вакцина, активная в отношении токсинов типов A, B, C, D и E, затем она была заменена новой гептавалентной вакциной. Иммунизация также проводится среди персонала, работающего с ботулотоксином в медицине, промышленности (при производстве препаратов токсина) или исследовательских лабораториях [8].
Ботулотоксин проникает в энтероциты путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, для которого необходим С-концевой участок тяжелой цепи, попадает в кровоток и затем эндоцитируется нейронами [9]. Связывание токсина с мембраной клетки описывается моделью двух рецепторов: сначала яд узнается ганглиозидами с двумя и более остатками сиаловой кислоты, например, GT1b. Аффинность этого взаимодействия невысока, но в результате он более эффективно связывается со вторичными рецепторами — мембранными белками Syt-II и SV2C. В результате эндоцитоза ботулотоксин оказывается в эндосомах. Затем происходит транслокация легких цепей через эндосомальную мембрану. При этом тяжелые цепи формируют в мембране канал, через который проходит легкая цепь.Транслокация ингибируется агентами, препятстсвующими снижение рН эндосом (например, хлорохином).
Ботулотоксин блокирует передачу импульса от нервного окончания к мышце, действуя на процесс выброса нервным окончанием нейромедиатора ацетилхолина из везикул. Везикулярный транспорт необходим для жизнедеятельности всех клеток человека. Существует механизм адресной доставки везикул к месту назначения в клетке — к поверхности клетки или органеллам вакуолярной системы (системы внутренних мембран), к которой относятся аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум, лизосомы. Направленный транспорт возможен благодаря системе взаимного узнавания везикулы и пункта назначения за счет связывания белков SNARE, встроенных в их мембраны. Механизм направленного транспорта внутриклеточных везикул играет большую роль в функционировании нервных клеток, поскольку их многочисленные отростки формируют контакты с другими клетками и функционально различны. В частности, такая система необходима для выброса нейромедиатора и передачи нервного импульса от нейрона к мышце. Нейромедиатор транспортируется в нервное окончание, где сохраняется вблизи пресинаптической мембраны и высвобождается при возбуждении нейрона за счет слияния с транспортной везикулы и пресинаптической мембраны нейрона.
Ботулотоксин нарушает нормальный процесс выброса нейромедиатора ацетилхолина двигательными нейронами, расщепляя одну из молекул, необходимых для связывания везикулы с пресинаптической мембраной. В результате нервно-мышечная передача блокируется и развиваются мышечные параличи. Если они затрагивают дыхательные мышцы, то это может привести к летальному исходу. Помочь таким больным можно путем искусственной вентиляции легких. Обычно она требуется в течение 4-6 недель. Действие токсина длится от нескольких недель до нескольких месяцев, после чего передача импульсов нормализуется. Восстановление нейронов после отравления ботулотоксином происходит в две стадии: на первом этапе наблюдается рост новых нервных окончаний, обеспечивающих нормальную иннервацию мышцы, затем восстанавливается функция исходного нервного окончания, после чего вновь образовавшиеся «дочерние» окончания деградируют [10].
В мембране везикулы находится R-SNARE (Soluble NSF Attachment Protein REceptor), в мембране органеллы-мишени — Q-SNARE. Существуют различные типы SNARE, благодаря чему везикула, маркированная определенным типом R-SNARE, направляется к определенной органелле, несущей «комплементарный» Q-SNARE. SNAP-25 (один из R-SNARE) — это молекула, которая необходима для экзоцитоза пузырьков с нейротрансмиттером ацетилхолином в различных нейронах, в частности, в мотонейронах. Выброс ацетилхолина из нервного окончания заставляет иннервируемую мышцу сократиться. Легкая цепь ботулотоксина типа А представляет собой протеазу, которая способна специфически связывать и разрезать молекулу SNAP-25. Ботулотоксины типов B, D, F, G и легкая цепь тетанотоксина расщепляют синаптобревин, который также является R-SNARE. Ботулотоксин типа С также атакует молекулу синтаксина-1, расположенную в пресинаптической мембране.
Известно, что в низких концентрациях многие яды могут быть использованы в качестве лекарств. Ботулотоксин — не исключение. Благодаря своей способности блокировать нервно-мышечную передачу он используется в очень низких концентрациях для снятия мышечных спазмов, сопровождающих многие заболевания. История использования ботулотоксина в медицине начинается в конце 60-х годов — американские и канадские офтальмологии стали применять его для лечения косоглазия и блефароспазма — непроизвольного сокращения круговой мышцы глаза, приводящего к смыканию век. Препарат хорошо себя зарекомендовал, и FDA (USA Food and Drug Administration) разрешила применять его для лечения этих заболеваний у взрослых пациентов. Затем список заболеваний, поддающихся лечению ботулотоксином, был существенно расширен. Он используется для лечения дистонии шейки матки, церебрального паралича, а также гипергидроза, или повышенной потливости , так как блокирует иннервацию потовых желез. В косметологии ботулотоксин (тип А, на фото), известный под марками «Ботокс» и «Диспорт», используется для коррекции морщин, так как вызывает временное обратимое расслабление мимических мышц. Впервые его использовал с целью коррекции асимметрии лица пластический хирург из Калифорнии, доктор Ричард Кларк в 1989 году [11]. В 2002 году FDA разрешило использование токсина в качестве средства от глабеллярных морщин — тех, что появляются между бровями, когда мы хмуримся [12].
Дата: 15 января 2013